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RNA分离与纯化

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  RNA分离与纯化

  包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料,mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品,RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。RNA中rRNA的数量最多,占总量的80%~85%;tRNA及核内小分子RNA占15%~20%;mRNA仅占1%~5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚,从基因克隆、表达与诊断的目的出发,目前对RNA的分离与纯化,主要集中在总RNA与mRNA上。

  总RNA的分离与纯化

  由于RNase的影响,为获得完整的RNA分子,就必须在总RNA分离纯化的最初阶段,尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下,高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性,能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子,目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备,但在RNA纯化时,应使用pH4.5~5.5的水饱和酸性酚,这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。尽管对剪切力不敏感,但RNA具有碱易变性,需要严格控制pH值。另外,在DNA与RNA的提取过程中,酚与氯仿经常结合、交替使用,主要在于两者合用时去除蛋白的效果更好,而且氯仿还能有效抑制RNase的活性,通过使酚脱水防止mRNA的丢失,加速有机相与水相的分层,去除植物色素和蔗糖以及核酸样品中的痕量酚。少量异戊醇的加入,其目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。由于高浓度胍类的使用,为防止SDS的沉淀,常改用十二烷基肌氨酸钠。对含量较低的样品,加入糖原可以提高RNA的回收率。

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