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DNA分离与纯化

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  DNA的提取

  为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适当的材料提取DNA。动植物中,小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子,植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中,谷氨酸菌体含7%~10%,面包酵母含4%,啤酒酵母含6%,大肠肝菌含9%~10%。从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易,多数病毒DNA分子量较小,提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大,一般达2×10道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA,除核DNA外,还有质粒DNA等。

  核酸的理化性质

  RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。

  DNA提取的几种方法

  1、浓盐法

  利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较。后种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用。15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA。

  2、阴离子去污剂法

  用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。

  3、苯酚抽提法:

  苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。

  4、水抽提法:

  利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% 、80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。

  5、试剂盒法

  根据DNA提取试剂盒说明书操作。

  DNA纯化

  首先利用琼胶电泳将不同分子量的DNA片段分开,将某一特定分子量区域的琼胶切下,利用DNA胶回收试剂盒将DNA从琼胶中溶出并浓缩。

 

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