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质粒载体构建

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  质粒

  质粒(plasmid)是一种寄于宿主细胞中独立于染色体外裸露的小型双链环状DNA 分子,一个质粒就是一个DNA分子,质粒广泛存在于多种细菌的细胞中,在某些蓝藻、真菌和绿藻的细胞中也发现含有质粒。在宿主细胞内,质粒一般以共价闭环DNA分子(cccDNA)的形式存在,体外在理化因子作用下,质粒可以成为开环DNA分子(ocDNA)和线形DNA分子(lDNA)。在变性条件下,质粒可以成为单链DNA分子(ssDNA)。在眼虫、衣藻等极少数真核生物的细胞中发现了线形质粒DNA分子。在自然界还发现了RNA质粒,如酵母的杀伤质粒(killerplasmid)。质粒DNA分子小和不足2kb,大的可达100kb以上,多数在10kb 左右。

  质粒的生物学特性

  1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA可以持续稳定地处于游离状态,但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随染色体复制而复制。

  2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒,并在真核细胞中表达,因此应用广泛。

  3、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少,把质粒分为严紧型复制质粒(拷贝数少,为1-5个)与松弛型复制质粒(拷贝数多,可达10-200个拷贝)。因此,作为载体的质粒应该是松弛型的。

  4、质粒的不亲和性:两种亲缘关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

  质粒载体人工构建的目的

  天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,因而不适合用作基因工程的载体,必须对之进行改造构建:

  1、加入合适的选择标记基因,如两个以上,易于用作选择。

  2、增加或减少合适的酶切位点,便于重组。

  3、缩短长度,切去不必要的片段,提高导入效率,增加装载量。

  4、改变复制子,变严紧为松弛,变少拷贝为多拷贝。

  5、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。

  理想的质粒载体应具备的条件

  1、分子量较小。

  2、松驰型,在受体细胞中有较多的拷贝数。

  3、具有一个以上的选择标记基因,形成重组质粒后,至少还要有一个强的选择标记。

  4、具有允许外源DNA片段克隆的位点,并且位于选择标记基因区内,插入外源片段不影响质粒的复制功能。

  5、能够导入寄主细胞,具备转化的功能。

  6、操作简单方便,可根据需要加装其它元件,构建不同用途的质粒载体。

  构建质粒载体应遵循的原则

  1、选用合适的出发质粒。

  2、正确获得构建质粒克隆载体的元件。

  3、根据要转化的受体细胞的特性,组装合适的选择标记基因。

  4、构建质粒表达载体,选用合适的启动子。

  5、力求构建过程简单化

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